BIOINFORMATICS WITH PARK-KLEIS

효과크기를 논하기 전에 P-value = 유의확률에 대해 언급하지 않을 수 없다.

어떤 통계적인 결론을 내릴 때 가장 많이 사용되는 지표인데,

정말 통계를 배우면서 지겹도록(?) 많이 나오고, 많이 사용된다.

효과 크기를 주제로 삼았는데, 왜 유의확률 이야기를 먼저 꺼내냐면..

통계검정을 할 때, 유의확률을 너무도 절대적인 기준으로 삼을 때, 검정 결과 해석에 오류가 있을 수 있기 때문이다. 

생각보다 의학•보건 저널에서 이러한 p-value의 오류는 매우 매우 많이 보인다.

📖 예를 들어보자.

1. 도쿄 사람들의 평균 키가 런던 사람들의 평균 키보다 유의미하게 다른지 통계적으로 검정하고 싶어

각 두 도시에서 표본을 추출하여 t-test를 실시했다.

그 결과 p-value 가 0.01로 나와 두 도시 사람들의 키는 유의미하게 다르다고 결론을 내렸다.

마찬가지로,

2. 베를린 사람들의 평균 키가 파리 사람들의 평균 키보다 유의미하게 다른지 통계적으로 검정하기 위해

두 도시에서 표본을 추출하여 t-test를 실시했다.

그 결과 p-value 가 0.001로 나와 두 도시 사람들의 키는 유의미하게 다르다고 결론을 내렸다.

❓그럼 여기서 생각해보자.

'도쿄-런던' 사람들의 키 차이에 대한 p-value는 0.01, '베를린-파리' 사람들의 키 차이에 대한 p-value는 0.001이다.

⇨ "베를린-파리 사람들의 키 차이에 대한 p-value가 더 작으니까 이 두 도시 사람들의 키 차이가 '도쿄-런던' 도시 사람들의 키 차이보다 더 크겠군" 이라고 해석 할 수 있을까?

(당연히 안 되니까 이런 질문을 했겠지)

여기에서 P-value의 역할은

'도쿄-런던' 사람들의 키 차이가 통계적으로 유의미하게 다르다는 것, '베를린-파리' 사람들의 키 차이가 통계적으로 유의미하게 다르다는 것에서 끝나야 한다.

P-value가 더 작다고 해서 그것이 더 큰 차이가 있다는 정보를 주지 않음을 항상 염두에 두어야 한다.

다시 말하면, P-value가 더 작다고 해서 그것이 귀무가설이 얼마나 잘 못 되었는지가 아니라는 것이다.

따라서  "베를린-파리 사람들의 키 차이에 대한 p-value가 더 작으니까 이 두 도시 사람들의 키 차이가 '도쿄-런던' 도시 사람들의 키 차이보다 더 크겠군" 이라고 해석 할 수 있을까? 에 대한 대답은..

⇨ "당연히 이렇게 해석하면 안 된다." 이다. 

P-value의 개념을 다시 한 번 짚어보면..

유의확률은 '귀무가설 하에서' 통계량을 관측할 확률이다.

이는 아래 그림에서도 잘 표현이 된다.

위 키 차이에 대한 예시를 다시 한 번 살펴보면,

1) '도쿄-런던' 사람들의 평균 키 차이는 10cm, 이에 대한 p-value는 0.01,

2) '베를린-파리' 사람들의 평균 키 차이는 5cm, 이에 대한 p-value는 0.001 라고 할 때,

"귀무가설(Null hypothesis) = 두 도시 사람들의 키 차이는 없다." 이므로

'도쿄-런던' 사람들의 평균 키 차이는 10cm, 유의확률이 0.01이라는 의미는

⇨ "두 도시 사람들의 키 차이가 없는 것이 사실이라고 했을 때,

     평균 키 차이가 10cm 가 관측될 확률이 0.01" 이라는 의미이다.

마찬가지로,

'베를린-파리' 사람들의 평균 키 차이는 5cm, 유의확률이 0.001이라는 것은

⇨ "두 도시 사람들의 키 차이가 없는 것이 사실이라고 했을 때,

     평균 키 차이가 5cm 가 관측될 확률이 0.001" 이라는 의미이다.

따라서 더 작은 유의확률이라고 해서 그것이 더 큰 차이를 의미하는 것이 아님을 위 예시에서 살펴보았다.

그럼 이러한 차이를 보여주는 통계량이 있을까?

(있으니까 물어봤겠지)

당연히 있다!

그것이 바로 <Effect Size = 효과 크기>인데, 여기에서 너무 말이 길어져서 다음 글에서 이어서 살펴보도록 하겠다.

여기에서는 일단 <p-value가 더 작음 ≠ 더 큰 차이> 를 명확하게 짚고, 앞으로 p-value를 해석할 때 유의하도록!

Pangenome 분석에 대해

(내가 이해하고자) 쓰는 포스트.

❗Pangenome을 위해 필요한 몇 가지 개념들

✔️COGs: Clusters of Orthologous Groups of proteins

 - COG db는 complete genomes의 enconded protiens를 phylogenetic classify를 위한 시도로 만들어짐.

✔️PGfams: Cross-genus families

 - The cross-genera protein families 는 대표적인 proteins를 클러스터링하여 계산 된다.

 - 대표적인 proteins는 (MCL inflation = 1.1)의 criteria로, genus-specific families.

 - 이는 corss-genera 또는 distant homologs to cluster 를 가능하게 함.

 - bv-brc.org 에서 그려주는 phylogenetic tree에 사용 됨.

✔️ SCG: Single-copy core gene

 - A gene that is found in the vast majority of genomes and yet occurs only once within a single genome.

- Single-copy core genes play a central role in pylogenetics.

- Commonly used SCGs can be identified across a set of genomes through sequence homology searches (via BLAST or HMMs).

- SCGs can also be identified de novo through pangenemics for relatively closely related genomes.

- The number of SCGs will decrease with decreasing resolutions of taxonomy.

✔️ HMMs: Hidden Markov Models

 - prediction (description) tool for a future state, given the knowledge of current state(=observation) in the sequence.

 - HMMs are widely used for many forms of sequence analysis, such as database searches, gene prediction, solving pairwise and multiple sequence alignment problems.

 - HMMs have advantages for solving the homology detection problem.

 - anvi'o 에서는 16S rRNA profiling, Bacteria_71 profiling, Protista_83 profiling 등에 사용 됨.

가뜩이나 문서작업 정말 귀찮은데

표(Table) 까지 내 마음대로 움직여주지 않으면 진짜 화가.. ㅎㅎ

각설한 후,

표에서 행 높이를 조절하고 싶으면

1) 높이를 조절하고 싶은 셀의 밑 줄이나 윗 줄에 커서를 댄 후 줄을 조절한다.

2) 레이아웃에서 행의 높이를 조절한다. (아래 사진 참고)

높이나 넓이를 변경하고 싶은 표의 테두리(위, 아래 상관 없음)에 커서를 갖다둔 후,

더블클릭을 하면 아래 화면과 같이 레이아웃이 뜨는데,

그럼 아래 그림에서 빨간 박스 안에 있는 높이의 화살표를 누르거나 직접 cm를 타이핑해서 높이를 조절하면 된다.

보통 이 두 방법이면 행 높이 조절이 된다.

근데.. 표에서 행을 나눈 줄을 아무리 끌어보아도 행 (또는 셀)의 높이는 바뀌지 않고 그대로이고,

레이아웃에서 높이를 조정해도 행의 높이가 그대로일 때가 있는데, (급할 때는 진짜 짜증이..)

그 때는 아래 방법을 추천한다.

1. 먼저 표에 커서를 갖다 대면 아래 그림의 빨간 박스와 같은 아이콘이 뜨는데, 저걸 클릭하게 되면 표의 모든 셀이 선택이 된다.

 그 다음 저 아이콘에 커서를 다시 가져간 후에 우클릭을 한다.

2.  우클릭을 하면 다음과 같은 화면이 나오는데, 여기에서 "표 속성" 을 선택한다.

3. 표 속성에서 "행"에 들어가면 아래 그림과 같이 "크기"의 "높이 지정(S)" 네모 칸이 선택되지 않았을 것이다. 높이 지정에 체크표시를 해준다. 

4. 높이 지정에 체크표시를 하면 아래 그림과 같이 행 높이(I)를선택할 수 있는데, 저걸 "고정"으로 선택한다. 그리고 높이 지정에서 사용자 마음대로 표의 높이를 조절해준다. (나는 0.5 cm 로 해줬다.)

5. 표의 행 높이가 줄어든 것을 확인할 수 있다.

끝!

Ⅰ. Sequence Generation : 염기서열 생성

⇨ NGS 장비에서 DNA fragment(조각)의 염기 서열을 식별

• 짧은 DNA fragment로부터 식별된 염기 서열은 리드 단위로 생성되고, 염기서열 정보는 FASTQ 파일로 생성됨.

Ⅱ. Sequence Alignment

⇨ Reference genome 과 비교하여 DNA fragment의 원 위치를 추정

• 각 리드의 reference genome 내 위치 & alignment 결과가 SAM or BAM 파일로 저장됨.
• SAM or BAM 파일을 이용해서 '모든 genome 상의 위치에 대해 align 된 리드의 개수 계산
• 특정 유전자 or 영역에 대해 Depth of coverage 계산

Ⅲ. Variant Calling

⇨ Reference genome과 생성된 서열 중 차이가 있는 부분을 검출.

• 검출된 변이는 VCF 파일로 저장

Ⅳ. Variant filtering & Variant Annotation

⇨ 변이 검출 과정에서 false positive로 생각되는 변이를 제거

⇨ 각 변이에 대한 관련 정보를 추가. 

평소에 자주 쓰던 rename 명령어를 적용하려고 했는데, 처음 보는 문구가 뜨면서 파일 명이 바뀌지 않았다.

따라서 까먹기 방지용으로 rename 에러, 오류 발생시 대처(?)에 대해 남겨보도록 하겠다.

rename 명령어의 사용법은

"rename 바꾸길원하는문구 바꿀문구 대상파일"

내가 이름을 바꾸고 싶은 파일들은 다음과 같다.

위 파일들의 이름 중 "URL-00_12345678" 부분을 "Norm"으로 바꾸고 싶어 평소에 쓰던 rename 명령어 용법대로 

다음과 같이 입력을 했다.

그런데, 다음과 같은 처음 보는 에러 문구가 뜨면서 rename이 되지 않았다.

이럴 때에는 rename 명령어를 다음과 같이 sed 명령어 사용하듯이 적어주면 된다.

rename 's/바꾸길원하는문구/바꿀문구/g' 대상파일

이후, ls 명령어를 사용하면 다음과 같이 파일명이 변경된 것을 확인할 수 있다.

두 그룹의 모평균 비교를 위한 검정을 할 때 가장 많이 사용되는 방법 중 한 개인

"2-sample independent t-test"가 있다.

두 그룹 비교를 위해 가장 많이 사용되는 방법 중 한 검정법인데, 여러 까다로운(?) 가정들이 있다.

Two-sample independent t-test 통계검정법 중에서도,

모수적 검정법을 사용하려면 다음 가정들을 모두 만족해야 한다.

📌 Assumption 1

- 두 샘플 그룹은 서로 독립일 것

📌 Assumption 2

- 두 샘플 그룹의 평균이 모두 정규성을 만족할 것

- 모집단이 아님! "샘플 그룹의 평균"이 정규분포를 따라야 한다는 것 ⇨ 중심극한정리

📌 Assumption 3

- 두 샘플 그룹의 분산이 등분산일 때와, 이분산 일때를 구별해야 함.

❓2 sample independent t-test를 실시할 때, 위 가정을 어떻게 만족해야 하는지 예시를 통해 살펴보자.

📏 북미에 위치한 A 도시와 중앙아시아에 위치한 B 도시 주민들의 키 평균을 비교하고자 한다. 

내 가설은 A 도시 주민과 B 도시 주민들의 키는 유의미하게 차이가 있다는 것이다.

⇨ 귀무가설과 대립가설은 다음과 같다.

- Null hypothesis (귀무가설=영가설) : 

A 지역 주민의 키 평균 = B 지역 주민의 키 평균

- Alternative hypothesis (대립가설) : 

A 지역 주민의 키 평균 ≠ B 지역 주민의 키 평균

단, 대립가설은 나의 가설이 어떠냐에 따라 (ex. A>B, B>A) 달라질 수 있다.

A 도시에는 100 만 명의 주민이 살고 있고, B 도시에는 50만 명의 주민이 살고 있다고 해보자.

✔️ A 도시 사람들의 키와 B 도시 사람들의 키는 독립이다. (Assumption1 만족)

위 가설을 검정하기 위해서 총 150 만 명에 해당하는 모든 주민의 키를 전수조사하는 것은 불가능에 가깝다. 

따라서 우선 각 지역의 주민들을 랜덤으로 뽑아(=랜덤샘플링), 각 지역을 대표할 수 있는 표본을 구해야 할 것이다. 

이를 위해 각 도시를 대표할 수 있는 주민 100명을 각각 뽑아 평균을 조사하였다.

원래 정석으로는 주민 100명(=sample size)을 여러 번(예를 들어 30번=number of samples) 추출을 해야한다.

이렇게 예를 들어 30번을 추출한다 가정하면, 총 30개의 표본평균이 나올 것이고, 이 표본 평균들이 정규분포를 따르게 되는 것이다. (=중심극한정리)

그러나 현실적인 문제로 이렇게 샘플링을 하는 것은 많은 경우 불가능하므로,

첫 번째 샘플링 그룹의 표본평균을 보고, 이를 사용하게 된다.

중심극한정리에 따라 표본의 평균은 정규분포를 따른다.

즉, A 도시 주민의 키의 분포는 다음과 같다. 

$$ N(\mu_{1},\sigma^{2}) $$

한편 B 도시 주민의 키의 분포는 아래와 같다. 

$$ N(\mu_{2},\sigma^{2}) $$

 ✔️ A 도시 사람들의 키와 B 도시 사람들의 키는 정규성을 만족한다. (Assumption2 만족)

보통은 A도시에서 뽑힌 샘플과 B도시에서 뽑힌 샘플을 각각 shapiro-wilks 검정을 통해 정규성을 만족하는지 살펴본다.

여기서 잠깐❗

통계학을 배울 때 매우 중요하다고 배우는 것이 있는데, 바로 "중심극한정리"이다. 모집단의 분포가 어떠하더라도, 표본 평균은 정규분포를 따른다는 것이다.

만약 모집단이 포아송 분포를 따르고, 랜덤샘플링으로 표본을 30개씩 뽑는다면,

이 표본의 평균의 분포는 정규분포를 따른다.

모집단의 개체 수가 10,000 개이고, 30개 씩 100번 랜덤샘플링을 하면,

100개의 표본 평균 분포은 정규분포를 보이게 된다. 

따라서 원래는 랜덤샘플링을 여러 번 해야 정확하지만, 현실적으로는 불가능하기 때문에 한 번의 랜덤샘플링을 하고 이 표본의 평균이 모집단의 평균을 대표한다고 할 수 있다.

그런데..

 ❓❓ '샘플이 30개 이상이면 근사적으로 정규분포를 따르니까 정규성검정 안해도 된다고 했는데?' 

t-test 검정에 있어 정규성 가정에 대해서는 말이 많다. 결론적으로는 샘플이 크면 정규성 가정을 무시하고 t-test를 해도 좋지만, 그 상세한 이유는 나중에 다루기로 한다.

 ✔️ 마지막으로 두 그룹의 등분산 검정을 실시하여 두 그룹의 분산이 비슷하다면 통계프로그램에서 등분산의 조건을 주어 t-test를 진행하면 된다. 

 만약 등분산 검정에서 두 그룹의 분산이 다르다면 welch 검정 (or Satterthwaite)를 사용하면 된다.

 이산형 확률분포의 종류

 : 베르누이분포, 이항분포, 이산형균등분포, 기하분포, 초기하분포, 음이항 분포, 포아송 분포 등

 각 이산형 확률분포를 살펴보도록 하겠다. 

이산형 확률변수의 적률생성함수는 다음과 같은 형태로 표현된다.

$$ M_{X}(t)=E(e^{tX})=\sum_{x=0}^{\infty}e^{tx}f(x) $$

1. 베르누이 분포

베르누이 시행의 확률변수 X의 분포는 X=1의 확률에 의해 정의된다. (X=0 or 1)

P=P(X=1)=P(성공)

베르누이 시행의 확률질량함수 f(x)는

$$ f(x) = p^{x}(1-p)^{1-x}, x=0, 1 $$

베르누이 분포의 기댓값과 분산은 다음과 같다.

E(X)=p, Var(X)=p(1-p)

베르누이분포의 적률생성함수는 다음과 같다.

$$ M(t)=E(e^{tx})=(1-p)+pe^{t} $$

적률생성함수 유도 과정은 아래와 같이 진행할 수 있다.

$$ M(t)=E(e^{tX})=\sum_{x=0}^{1}e^{tx}f(x)=\sum_{x=0}^{1}e^{tx}p^{x}(1-p)^{1-x}=e^{0}p^{0}(1-p)^{1}+e^{t}p^{1}(1-p)^{0}=(1-p)+pe^{t} $$

적률생성함수를 t에 대해 1차 미분한 후 t값에 0을 대입하면 평균을 도출할 수 있다.

베르누이 분포의 적률생성함수를 1차 미분하면 

$$ M(t)=(1-p)+pe^{t}\Rightarrow M^{'}(t)=\frac{d}{dt}(1-p+pe^{t})=pe^{t} \Rightarrow M^{'}(0)=p $$

2. 이항분포

베르누이 시행을 독립적으로 n번 반복하여 시행한 경우, 성공한 총 횟수를 X라 정의하면, 이 확률변수 X는 이항분포를 따른다.

이항분포의 확률질량함수 f(x)는 다음과 같다.

$$ f(x)=\binom{n}{x}p^{x}(1-p)^{n-x}, x= 0,1,2,...,n $$

이항분포의 기댓값 E(X)=np, Var(X)=np(1-p) 이다.

이항분포 B(n, p)를 따르는 확률변수의 적률생성함수는 다음과 같다.

$$ M(t)=\sum_{x=0}^{n}e^{tx}f(x)=\sum_{x=0}^{n}e^{tx}\binom{n}{x}p^{x}(1-p)^{n-x}=[(1-p)+pe^{t}]^{n} $$

만약 n이 1이라면 베르누이분포의 적률생성함수가 된다.

3. 포아송분포

포아송분포는 이항분포에서 반복횟수인 n이 충분히 크고 성공률 p가 0에 가까울 정도로 작으면서 평균이 np=⋋일 때의 분포이다.

포아송분포는 이항분포와 밀접한 관계가 있는데, p의 값이 매우 작고 평균이 일정할 때 n이 커지면 이항분포는 포아송분포로 표현된다.

n ⇨ ∞ , p ⇨ 0 이며, np=⋋라고 가정하면 아래 식이 성립한다.

$$ \displaystyle \lim_{ n\to \infty}\binom{n}{x}p^{x}(1-p)^{n-x} $$

위 식을 풀어보면,

$$ \displaystyle \lim_{ n\to \infty}\binom{n}{x}p^{x}(1-p)^{n-x}=\displaystyle \lim_{ n\to \infty}\frac{n(n-1)\cdots (n-x+1)}{x!}(\frac{\lambda}{n})^{x}(1-\frac{\lambda}{n})^{n-x} $$

또 위의 식을 풀어보면 다음과 같다.

$$ \frac{\lambda^{x}}{x!}\displaystyle \lim_{ n\to \infty}(1-\frac{\lambda}{n})^{n}(1-\frac{\lambda}{n})^{-x}(1-\frac{1}{n})(1-\frac{2}{n})\cdots (1-\frac{x-1}{n}) $$

위 식에서 다음 성질을 만족하기 때문에

$$ \displaystyle \lim_{ n\to \infty}(1-\frac{\lambda}{n})^{n}=\displaystyle \lim_{ n\to \infty}[(1-\frac{\lambda}{n})^{\frac{n}{-\lambda}}]^{-\lambda}=e^{-\lambda} $$

다음과 같이 이항분포가 n이 매우 커지고 p값이 작을 때 포아송분포로 근사함을 표현할 수 있다.

$$ \lim_{ n\to \infty}\binom{n}{x}p^{x}(1-p)^{n-x}=\frac{\lambda^{x}e^{-\lambda}}{x!} $$

포아송분포의 확률질량함수는 다음과 같이 표현할 수 있다.

$$ f(x)=P(X=x)=\frac{\lambda^{x}e^{-\lambda}}{x!}, x=0,1,2,\cdots (\lambda>0) $$

확률질량함수를 통해 포아송분포의 적률생성함수를 아래와 같이 도출할 수 있다.

$$ M(t)=\sum_{x=0}^{\infty}e^{tx}\frac{\lambda^{x}e^{-\lambda}}{x!}=e^{-\lambda}\sum_{x=0}^{\infty}\frac{(\lambda e^{t})^{x}}{x!} $$

이를 테일러 전개를 이용하여 정리하면 

$$ M(t)=e^{-\lambda}\sum_{x=0}^{\infty}\frac{(\lambda e^{t})^{x}}{x!}=e^{\lambda(e^{t}-1)} $$ 

위 적률생성함수를 t에 대해 1차 미분한 후 t에 0을 대입하면, 포아송분포의 기댓값을 구할 수 있다.

처음 통계를 접할 때 이해하기 어려웠던 것이 모평균, 표본평균, 표본평균의 평균 개념이었다.

지금 생각해보면 저 단어의 의미를 잘 살펴보기만 하면 크게 어렵지 않은 개념인데,

처음엔 다 어렵듯이 표본평균과 표본평균의 평균이라는 개념이 잘 이해가 가지 않았다. 

표본평균은 표본들의 평균이고, 왜 구하는지 이해가 갔는데

표본평균의 평균은 도대체 왜 구해야하는지 잘 이해가 가지 않았다.

표본평균은 중요한 성질들이 있다. 모집단을 임의로 정한 후, 시뮬레이션을 해보면,

1) 표본평균의 전체평균은 모평균과 같다.

2) 표본평균은 모평균의 비편향추정량(unbiased estimator)이다.

3) 표본평균은 모평균과 서로 다르지만 표본평균의 도수들은 모평균 주위에 많이 몰려 있다.

4) 모든 가능한 표본평균의 분포는 모평균을 중심으로 대칭형이다.

모집단이 매우 크다면, 모든 가능한 표본을 찾아 표본평균의 분포를 찾는 것은 불가능하지만

위 성질들은 ①모집단이 크거나 ②다른 분포형태를 가져도, 변함이 없다.

모평균 µ와 모분산 σ² 를 갖는 모집단에서 추출한 랜덤표본을 X₁ , X₂ , ... , X_n 이라 하면, 이들의 표본평균은 다음과 같다.

$$ \overline{X} = \frac{1}{n}(X_{1}+X_{2}+...+X_{n}) $$ 

$$ E(\overline{X})=\mu, Var(\overline{X})=\frac{\sigma^{2}}{n} $$

모집단이 무한모집단이고 표본크기가 충분히 크면 모집단이 어떠한 분포이더라도 표본평균의 분포는 근사적으로 정규분포를 따른다. 이를 중심극한정리(central limit theorem)라 한다. 

중심극한정리에 따르면 모집단의 분포와 관계없이 표본크기가 충분이 크면 표본평균은 정규분포를 따른다. 

$$ \overline{X} \sim N(\mu, \frac{\sigma^{2}}{n}) $$

따라서 이항확률변수(binomial)의 분포 역시, 표본크기 n이 충분히 큰 경우 근사적으로 정규분포를 따르게 된다.

이항분포 B(n, p)를 따르는 확률변수 X는 n이 충분히 클 때, 근사적으로 평균이 np, 분산이 np(1-p)인 정규분포 N(np, np(1-p))를 따른다.

$$ \frac{X-np}{\sqrt{np(1-p)}} \sim N(0, 1) $$